航空医学研究所附属医院分子病理中心

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一、背景介绍

遗传病泛指由遗传物质（DNA和染色体）改变所导致的疾病，主要包括染色体病、单基因遗传病、多基因遗传病、线粒体遗传病等。单基因遗传病呈现孟德尔遗传，根据OMIM数据库的统计，目前已知单基因遗传病约有5000～7000种，已明确致病基因的约有3247种，其中约有60%为神经遗传疾病，另外约有20%为具有神经系统症状的遗传病。中国因为人口基数大，是世界上出生缺陷高发国家之一，每年约有100万出生缺陷的婴儿出生，占出生人口的4%-6%，遗传病是人群中出生缺陷的主要组成部分。

罕见病是指患病率很低、很少见的疾病，其中大部分为罕见遗传病。世界卫生组织(WHO)将罕见病定义为患病人数占总人口的0.65‰-1‰之间的疾病或病变，而各国(地区)对罕见病认定的标准上存在一定差异。美国罕见病定义是患病人数少于20万人(约占总人口0.75‰)的疾病；日本罕见病定义是患病人数少于5万人(约占总人口0.4‰)的疾病；澳大利亚定义是患病人数少于2000人(约占总人口0.1‰)的疾病；欧盟罕见病定义是患病率低于0.5‰的疾病。各国对罕见病的不同定义，与其对罕见病药物研发的激励政策及对罕见病诊疗费用的覆盖范围有关。中国专家对罕见病的共识：成人患病率低于五十万分之一，新生儿中发病率低于万分之一的遗传病可定为罕见遗传病。

基因诊断是遗传病诊断的金标准，对常见罕见遗传病进行基因诊断，可帮助鉴别疾病、预测病情进展、早期采取干预措施等，例如：MTHFR，ACE，FVL，FII，PDF4D基因的组合筛查，可以很好提供早期预防脑卒中的发生；ApoE，Tau，LDLR等基因的筛查，也可为老年痴呆患者提供早期治疗的依据；核黄素反应性脂质沉积病 (riboflavin responsive lipid storage myopathy, RR-LSM)诊断明确后只需补充维生素就可以控制病情，但如果延误诊断与治疗则后果严重。此外基因诊断最为重要的是可用于产前干预，防止下一代遗传病的发生，具有重要临床和社会意义。 

二、国内外遗传病诊断现状 

 国外神经遗传病诊断发展较为迅速。美国目前有数百个遗传病分子诊断实验室，开展上千种遗传病分子诊断，参与机构包括实验室、公司或非营利机构等。国外遗传病诊断有以下几个特点：

1. 检测项目多，并且发展迅速。这主要与国外基础研究较为发达有关，临床医师该方面培训也相对较好。另外进行生物行业基础实力雄厚，比较容易开发新的检测技术与项目。

2. 参与机构多。遗传病基因检测价格相对比较昂贵，在国外许多遗传病检测进入医疗保险目录，患者经济负担较小，比较容易选择基因检测，有效的市场进一步促进遗传病检测行业的发展。

3. 规范化。美国CLIA实验室均需标准化，实验室认证和人员资格认证遵循同样的程序。欧盟遗传诊断实验室。以国家标准化实验室为质量控制和资质发放单位，标准化实验室制备各类需要基因检测项目的标准品供需要提供基因检测实验室作为临床基因检测资质的检验指标。此外美国和欧盟有多个机构经常发布更新神经遗传病检测指南，检测机构根据指南进行遗传病基因检测。例如欧洲神经科学协会联盟（European Federation of Neurological Societies，EFNS）针对多种神经遗传疾病分子诊断发布多项指南，并定期进行更新。

4. 监管力度大。美国立法对基因检测进行规范，所有参与基因检测的机构都受CLIA(Clinical Laboratory Improvement Amendments)的监管。CLIA建立相对严格并苛刻的标准规范基因检测行业，包括CLIA实验室均需标准化，通过实验室认证和人员资格认证，需有规定的质量控制、质量改进、质量保证等全方位要求来设计、验证、改进适合于临床使用的基因诊断方法等。

 国内遗传病检测与国外相比存在较大差距。我国能够在实验室检测的遗传病仅100多种。目前虽有数百家机构参与遗传病检测，但其中一部分甚至连实验室都没有，实验室质量良莠不齐，缺乏标准化、规范化、系统化的检测体系，检测结果的解释也比较混乱。造成上述原因有多个方面，例如我国生命科学起步晚、实验室技术条件差等、医疗保险未覆盖遗传病检测等。另外。我国临床医师尤其是神经科大夫对于神经遗传病的知识相对缺乏，临床上也没有对该类疾病进行足够的重视。神经遗传病种类繁多。也给临床医师提出更高要求。虽然我国遗传病检测与国外存在一定差距，但随着经济发展，人们对更高医疗服务的需求，国内遗传病检测将获得迅速发展。

三、神经遗传病检测平台的构建 

我们参照国外神经遗传病检测规范和要求，构建了神经遗传病检测平台，目前为止可检测超过一百种神经遗传病。神经遗传病基因检测不仅仅是对某个基因进行分析，观察其突变情况。完整的神经遗传病基因检测包括选择目的基因、采用合适的检测方法并遵循检测规程、检测结果分析、检测结果解释几个部分，每个部分都应参照国内外权威指南进行规范化，才能获得较好效果。

1. 目的基因选择。目前由于国内临床医师对神经遗传病的理解还不够深入，导致临床上常常忽略某些遗传病，即使是怀疑到某种神经遗传病的可能，在选择目的基因方面也存在一定困难，大部分是根据有限的文献报道进行选择。作为检测机构在目前条件下应和临床医师充分沟通，帮助选择合适的目的基因，降低神经遗传病患者的经济负担，也有利于临床医师对神经遗传病基因诊断的进一步理解和信任。

我们选择进行检测的基因遵循以下步骤：

（1）检测样本临床信息的收集。根据临床表型选择可能的致病基因十分重要，因此要和临床医师进行沟通，在详细的临床表现和其他检测结果分析的基础上进行选择，并且在检测过程中随时保持及时沟通。例如肌肉疾病的免疫组化结果分析可定位到发生突变的蛋白，对于指导选择目的基因具有重要意义。我们进行神经遗传病检测时，针对不同类型的神经遗传病设计了不同的送检样品表，里面包括的信息对于该类型神经遗传病中可能的亚型尽可能达到鉴别诊断的目的。

（2）明确家系发病情况，结合疾病遗传特征进行分析。神经遗传病的遗传特征对于选择目的基因十分重要，我们在检测时进行详细临床询问，获得患者家系发病情况，明确遗传方式；并尽可能采集家系相关成员的标本，以便于后续结果分析。

（3）参照权威遗传病检测指南和遗传病的统计资料，进行目的基因选择。许多神经遗传病的检测已经有机构发布检测指南，应遵循指南进行检测。例如约有5%的帕金森病（Parkinson’s disease,PD）为遗传性，有10多个致病基因，根据EFNS指南，SNCA基因检测仅限于家系中有多个成员发病证实为常染色体显性遗传（不是根据两代遗传）PD ；对于具有典型症状和常染色体显性遗传阳性家族史的PD应首先考虑进行LRRK2基因检测；散发PD应选择某些存在LRRK2基因热点突变的人种进行筛查，而对于发病年龄<40岁的散发PD，也可考虑进行parkin、PINK1和DJ-1基因检测。

对于尚无指南的神经遗传病，应根据发布的统计资料进行总结，从而有效选择目的基因。例如遗传性癫痫目前有约500种致病基因，包括常显、常隐、X-连锁、Y-连锁等。根据资料统计出生后第一年内发病的患者50%以上发现KCNQ2基因突变，其次为STXBP1；而对于Dravet综合征，70%-80%的患者可发现SCN1A基因突变；而对于局灶性癫痫如ADLTE，约50%患者可发现LG11基因突变。

（4）对于一些症状不典型、难以进行鉴别诊断的疾病进行基因组检测。一些临床上难以鉴别的神经遗传病致病基因较多，例如遗传性痉挛性截瘫，如果盲目选择单个基因检测可能不会提供任何有帮助的信息，第二代测序技术可对所有可能的致病基因进行检测。

需要注意的是，基于基因组的检测技术有可能会导致发现一些可能与所患疾病无关的位点变异，但这些位点变异有可能影响患者将来其他疾病的发生，从而给临床医师和患者亲属带来更多困惑。因此，最好的策略是进行有针对性的基因基因检测和生化检查，基于基因组的检测技术应该是最后才需要采取的方法，而且检测前一定要与患者及其家属进行良好沟通，提供心理支持和遗传咨询。

2. 采用合适的检测方法并遵循检测规程。

（1）检测方法的选择。不同类型神经遗传病对应的突变方式不同，应选择合适的检测方法。例如杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD) 60%-70%为大片段缺失/插入，因此我们首先选择DHPLC进行大片段缺失/插入检测。线粒体疾病存在异质性，直接测序分析可能造成假阴性，我们首选低含量突变检测方法进行扫描，发现突变后再结合测序结果进行分析。假性甲状旁腺功能减退症(pseudo-hvpoparathvroidism，PHP) 1a型主要与GNAS基因突变有关， 1b型与GNAS基因IA区域甲基化缺失有关，应同时采取两种方法进行检测。

（2）遵循检测规程。遵循检测规程，主要是指检测流程的标准化和质量控制体系。我们进行检测的实验室硬件满足临床基因诊断要求，管理方面严格遵循临床PCR实验室规范并参照美国CLIA实验室标准。实验室建立一系列标准操作流程（SOP），包括各种仪器使用以及不同检测项目的实施，实验操作人员经过严格培训。我们建立的良好的质量控制体系，例如引物的存放标准和定期复查、仪器定期校准与维护、人员培训与考核、检测结果的多人审查与复核等，保证检测结果的可靠。

产前诊断是神经遗传病诊断的重要内容。产前诊断遵循先证者原则，即必须在家系先证者中发现阳线突变才进行产前诊断。产前诊断遵循严格的规范和流程，例如知情同意书、遗传咨询、标准检测流程。例如欧洲产前诊断指南中明确建议，至少要做2个可以排除母源污染的STR位点，且要求检测灵敏度在10%以下并需附上灵敏度结果。我们采用DHPLC技术分析16个STR位点以排除母源细胞污染，保证检测结果的真实可靠。

3. 检测结果分析。检测结果分析主要是指阳性检测结果的分析，由生物信息学分析和数据库检索两部分组成。生物信息学分析首先是采用生物信息软件判断检测结果是否影响编码蛋白的结构和功能，例如突变类型的判断、保守序列分析、编码蛋白三维结构预测等，初步判断检测到的阳性结果是否具有病理意义。更为重要的是进行数据库检索，包括基因突变数据库和文献的检索，从而判断检测结果是否具有临床意义。需要注意的是，不同基因可能有多个数据库，要综合多个数据库结果进行判断，并对原始文献研究。如果发现数据库没有报道的突变需要查询最新文献。目前我国遗传病信息相对滞后，结果分析时需考虑其他国家的统计信息，但一定要考虑地区和人种差异，在实践中不断摸索和改进。

4. 检测结果解释。检测结果解释是直接对临床医师和患者提供建议的部分，需要遵循一定的规范进行科学的解释。目前国际上如何准确合理的解释遗传检测的结果并没有统一标准，甚至由谁来制定相应的标准以供包括从检测顾问到实验室技术人员在内的所有从业人员使用也没有解决。

我们将检测结果解释分为三类：阳性、阴性和未知临床意义。阳性或阴性是最明确的检测结果，但事实上有许多检测结果不能简单用阳性或阴性来描述。

阳性检测结果的判断依赖于检测结果的分析。先证者为阳性的家系，建议其直系亲属进行已发现突变的筛查，以明确家系成员发病风险，早期进行干预，并进行产前诊断指导。

阴性(正常)检测结果，特别是一些临床上强烈提示为某种遗传病的基因检测，我们首选考虑采用的方法是否合适，例如测序技术无法检测大片段缺失/重复；或者位点变异位于检测范围之外（内含子区、启动子区）。这类检测结果应该成为不能提供信息的阴性结果。其次和临床医师进行沟通，结合遗传学统计资料判断是否可选择其他潜在的致病基因进行检测。

 一些情况下会获得未知临床意义的检测结果，可能有或没有致病效应。生物信息学预测变异对编码蛋白的影响，采用不同预测软件得到不一致的结果，难以判定。这时应考虑检测患者父母。常显遗传病如果没有症状的父母发现同样变异，提示该变异可能没有意义；如果是新发突变则很可能有意义。常隐则比较复杂，需根据患者父母的突变携带情况进行判断。

检测结果的解释应和患者临床表现、家族史和其他检查紧密结合起来。患者临床表现、家族史和其他检查不仅可帮助选择目的基因，对于检测结果解释也十分重要。 

神经遗传病检测平台的构建关键是规范化，除此以外遗传咨询也非常重要。遗传咨询包括以下几个方面：权衡检测的利弊以及检测结果对患者及其家庭潜在的意义；有关遗传异常的本质和原因的教育；促进个人作出决策的一些必要信息；心理支持和治疗安排。

我们按照对神经遗传病检测规范化和遗传咨询的理解，目前建立了多种神经遗传病检测平台，包括细胞遗传、分子遗传、表观和生物信息学分析等，拥有染色体分析、FISH、大片段缺失/重复检测、基因序列变异检测、甲基化、实时荧光定量和低含量检测等技术，还和其他机构合作进行二代测序的临床应用。目前可检测的神经遗传病覆盖常见和罕见的单基因遗传病、染色体病和线粒体病。包括：老年痴呆相关基因检测、早发型帕金森氏病系列基因检测、脑卒中早期预警相关基因检测、癫痫相关基因检测、进行性肌营养不良、先天性肌营养不良、先天性肌病、远位型肌营养不良/肌病、离子通道病、肌原纤维病、肌糖原累积病、脂质沉积病、先天性肌无力综合征、运动神经元病、遗传性运动和感觉性神经病、遗传性共济失调、遗传性痉挛性截瘫等300多种疾病近500多个基因。

我们希望提供高质量、高水平的基因检测服务，建立起尽量完备的神经遗传性疾病的检测技术平台的实际应用，帮助和推动临床神经遗传病基因检测的进一步深入发展，为广大患者提供优质的服务。

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