下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)是对传统一代测序技术的革命性改变，该技术具有高通量和低单碱基成本的特点。全外显子组测序自2009年用于罕见遗传病分子病因学研究和诊断以来[1]，大大提高了分子诊断用于遗传病患者的效率。目前临床仍在不断积累经验以争取最大程度地发挥NGS在罕见遗传病诊断中的功效，下面就诊断流程的几个主要方面作简要讨论。

一、遗传性罕见病的临床初步鉴别绝大多数罕见病有遗传基础，此外致病原因还包括感染、环境毒理、饮食及化学物暴露等非遗传因素[2]。临床上有效鉴别是否为遗传性疾病，能提高NGS对罕见病的诊断率，从而间接降低医疗成本，提高临床功效性。临床医生在鉴别时需要综合考虑多种因素，包括对先证者的家族史、妊娠史、家庭社会生活环境的全面了解。

二、测试前的遗传咨询遗传检测是一项比较复杂的临床检测项目，患者及家属需要专业人员为其提供遗传咨询。由于NGS检测费用相对昂贵，项目种类也较多，且各有其优势和局限性，因此有必要进行测试前的遗传咨询。通过遗传咨询使患者及家属对检测的预期结果有一定客观的认识，对可能产生的和检测目的不相关的发现有知情选择，并能充分了解检测结果对家庭其他成员的潜在影响，咨询还应包括介绍此类测试的替代方案，以供患者及家属选择。目前对是否报道检测目的外的基因变异意外发现还没有统一的规定，这也是测试前咨询的重要内容[3]。

三、临床表型信息的采集及标准化表达医生收集完整、准确的临床表型信息是基因诊断的基础和出发点，临床外显子组或全外显子检测结果分析在很大程度上依靠对基因型-表型相关性的了解，因此全面准确地评估临床表型并用统一的标准术语描述记录尤为重要。通过从遗传疾病知识库[如在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)，Orphanet，Pubmed等]中搜寻基因与疾病、表型与基因的相关性，从而能够优先考虑和临床症状相关的基因的罕见功能性变异。为更好地描述临床表型，美国形态学要素协作组对体表畸形术语的标准化及含义作了定义，可以为临床医生描述畸形症状提供指导和依据。此外，国际人类表型标准用语联盟(Human Phenotype Ontology，HPO)也对人类疾病异常表型的标准化术语进行了规范化。目前HPO收录了11 000个和异常表型对应的词条，并提供了系统的分类管理[4]。特别是对OMIM、Orphanet和DECIPHER中记录的7 000多种罕见病及4 000多种常见病提供了HPO的注释，中文版开放平台的建立将对中文使用者的临床和科研工作起到极大的推动作用。

四、选择恰当的检测方法罕见遗传病的病种很多，其突变种类也很多，不同的突变需要用不同的检测手段。基于NGS的分子检测可以根据检测对象的多少分成单基因、基因包、临床外显子、全外显子组及全基因组的检测[5]。在NGS时代，单基因的检测仍然很有必要，在一些情况下是必须的，主要应用于以下一些情况：(1)临床能明确诊断、致病基因单一的疾病，如1型神经纤维瘤；(2)致病基因的变异不能为NGS所检测，最常见的包括脆性X染色体FMR1基因中CGG的扩增检测，普瑞德威利-天使综合征的甲基化分析等。基因包的检测对临床有特异表型但遗传异质性较强，需要作鉴别诊断的病种较为合适，其临床功效也在很大程度上取决于临床医生对临床诊断的把握度，也取决于已知致病基因能解释这类疾病的比例。由于新基因不断被发现，基因包也需不断地更新。临床外显子名义上包含所有已知的致病基因，但实际上无法完全实现，因为一是新致病基因的发现速度很快，二是许多曾经以为的致病基因事实上并不是或还没有足够的证据支持是明确的致病基因。全外显子组理论上应包含基因组的所有编码区域，但实际上由于各公司产品设计不同、测序过程中一些区域覆盖度不够、某些基因区域存在同源序列等原因，导致全外显子组测序无法对基因组的所有编码区域进行有效捕获与测序。全基因组测序已经开始常规用于拷贝数变异(copy number variation，CNV)的分析，只需很低的覆盖度(比如0.1X)就能检测出全基因组范围内的CNV，检测成本不超过目前一般的染色体芯片，但全基因组测序还没有常规性用于序列变异的检测，因为检测序列变异所要求的覆盖度在30X，测序的成本较高。相信随着新的测序技术的突破，最终会将我们带入全基因组测序的时代。

检测先证者父母及其他家庭成员，对明确致病变异很有帮助。最常见的是核心家系的检测(父母加先证者，Trio)。当该病症被认为最可能是由于其中一个亲本中的生殖细胞(精子或卵)突变而引起时，同时检测父母非常有助于快速鉴定是否为新发变异。大多数严重影响个体生殖健康的高外显性疾病往往是由于新发变异造成的，这在严重智力障碍和自闭症谱系障碍等患者中已经得到了充分证明。Trio检测还可以确认同一基因上不同变异的父母来源，从而确认变异的顺式或反式(复合杂合)的构型，这对于评估隐性遗传病特别重要。

五、测序数据质控及数据有效性评估NGS应用于临床检测必需经过对检测技术平台及检测项目的优化和验证，建立标准化流程和质量保障措施，以保证检测技术的有效性。在众多数据质量参数中，测序覆盖度对变异检出率有至关重要的影响。过低的测序覆盖度会导致漏检真正的变异，造成假阴性，另一方面也可能因不能有效过滤一些不真实的变异及界定不正确的合子状态而导致假阳性。根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)技术指南[6]，如全外显子组的测序，对于先证者标本，要求90%～95%区域的平均测序覆盖度应达到100X，而Trio测序，70X即可达到最低要求。

六、变异的临床意义分析分析序列变异的临床意义不是一个简单或直接的过程。过去所报告的致病变异可能并非真的致病性变异，因此变异的临床意义分析应基于最新的证据。过去分析过的一些变异在一段时间后或有新的证据出现后需要进行重新分析，因此变异的临床解读是一项持续性的工作。相同的变异在不同的评估原则下可能会呈现不同结果，ACMG/美国分子病理学学会(Association for Molecular Pathology，AMP)测序变异的致病性分析指南为我们制定了统一的原则，使得变异分析有规可循，但对原则的不同理解也仍然会导致不一致的结论[7]。此外，由于对疾病基因致病机制了解不够充分，同一基因可能会以不同的变异方式导致不同疾病，共享人群数据库中也缺乏足够的中国人群参照数据，这些因素都增加了变异临床意义分析的难度。对一个变异的分析有时需要花费大量时间精力查找阅读相关文献及数据库，即便如此也不一定能得出比较肯定的结论，目前很大一部分的变异只能归类为临床意义不明。笔者认为，对于没有其他依据可循的变异，实验室有必要开展功能性研究，这是一项有待发展的重要方向。迄今，已知超过5 000个基因被发现与人类疾病相关，任何一个实验室都无法做到对所有基因有充分的了解，因此实验室间共享经验、共享变异分析的结果是非常必要的，这就催生了ClinGen的诞生。ClinGen旨在通过专业实验室的合作，通过制定共识性原则的、临床共享资源的集中开发，达到共赢的目的，最终为患者提供更有效的服务[8]。

七、变异的临床相关性分析及报告ACMG指南将序列变异的临床意义分为五类：致病性(pathogenic，P)，可能致病性(likely pathogenic，LP)，临床意义不明(uncertain significance，VUS)，可能良性(likely benign，LB)和良性(benign，B)[7]。报告变异内容主要取决于以下几个原则：(1)对于诊断性检测，报告的变异应该和患者的临床表型有关联，这就需要通过临床相关性分析来决定，但临床相关性分析还没有一个定量的流程，主要看症状的吻合程度，除了要考虑相符的症状外，也要考量不相符的症状。一些不相符的症状在分析过滤变异时会被鉴别剔除。临床相关性分析的另一个重要内容是分析患者的所有症状是否都能被找到的变异所解释。对于预测性检测，比如产前检测，我们需要制定共识性的原则，分析界定可报、不可报的基因/变异种类。(2)与本次检测目的无关的、意外发现的变异是否纳入报告取决于测试前遗传咨询结果，根据患者或家属的选择来决定。(3)一般良性和可能良性的变异不会被纳入报告中。外显子组临床报告的内容和格式已由ACMG实践指南提出了建议，国内有关组织也有建议[9]。临床报告中重要的部分是提供支持变异分类的证据及证据的来源，并为送检医生及患者提供相关的建议。

八、遗传咨询是遗传检测不可缺少的重要环节，遗传咨询的对象包括送检医生、患者和家属。我国尚无一套针对NGS检测进行遗传咨询的原则和操作规范，需要在实践和研究中总结发展。笔者认为，中国遗传咨询师的主要工作是为临床医生及患者就基因检测报告提供针对性的诠释及咨询，包括分析明确遗传模式、评估疾病或症状的发生风险与再发风险以及生育的建议；解释遗传疾病的发病原因、疾病自然发展史、临床表现与可能的干预和治疗措施以及预后情况；结合心理评估识别患者及家属在情感、社会、教育以及文化等方面的理解及接受问题；评估患者和(或)家庭成员对出现疾病或存在疾病再发风险的理解及反应程度；充分了解并为患者及家属提供有效的医学、教育、经济以及心理等社会资源，包括权威性的信息源(书籍文献网站等)、专家库、互助组织等信息；引导患者及家属参与诊断及研究项目，提供知情同意的解释。目前主要的任务是培养一批掌握基因组学知识，并具备一定临床知识的遗传咨询师。

九、结语NGS为罕见病的早期确诊提供了可靠的技术平台，有助于患者尽早开展治疗干预，达到改善预后、降低疾病严重性的目的。希望随着临床检测质量管理的加强，NGS能更规范化地应用于临床。

本文转载自中华检验医学杂志2017年7月，已获作者授权。