遗传性肌肉疾病导致渐进性肌肉萎缩，经常导致早期死亡，治疗选择很少，也无法治愈。一些基因疗法使用无害的病毒载体将致病基因的功能性拷贝递送给细胞，在临床试验中显示出对一部分肌肉营养不良症的治疗前景，但也面临挑战。携带功能性基因拷贝的病毒载体需要高剂量才能到达整个身体的肌肉，而这些临床试验中使用的病毒载体往往最终地更多地进入肝脏而不是肌肉。这导致肝脏中的病毒载体含量过高，出现严重的不良副作用，甚至导致一些临床试验参与者的死亡。
在一项新的研究中，来自美国布罗德研究所和哈佛大学等研究机构的研究人员开发出一个新的腺相关病毒（AAV）家族---基因治疗中的基因递送主力，它们改善了对肌肉组织的靶向性，这对肌肉疾病患者可能更安全、更有效。这组病毒载体（他们称之为MyoAAV）到达肌肉的效率比目前临床试验中使用的病毒载体高10倍以上，并且在很大程度上避开了肝脏。他们发现，由于这种效率的提高，MyoAAV可用于递送治疗性基因，其剂量比其他研究和临床试验中使用的病毒载体低约100至250倍，有可能减少肝脏损伤和其他严重副作用的风险。相关研究结果于2021年9月9日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species”。论文通讯作者为哈佛大学教授、布罗德研究所成员Pardis C. Sabeti、Sabeti实验室的Mohammadsharif Tabebordbar和哈佛大学干细胞与再生生物学系教授Amy Wagers。
在这项新的研究中，这些作者描述了他们如何修改AAV的外层蛋白外壳，即所谓的衣壳，以构建MyoAAV。他们使用了一种他们开发的名为“利用转基因RNA在体内表达的AAV衣壳定向进化（Directed Evolution of AAV capsids Leveraging In Vivo Expression of transgene RNA, DELIVER）”的方法做到了这一点。
利用MyoAAV，这些作者将治疗性基因或CRISPR-Cas9基因编辑系统专门递送给肌肉细胞。他们改善了杜兴氏肌营养不良症小鼠模型和X连锁肌管性肌病小鼠模型的肌肉功能，其中杜兴氏肌营养不良症是最常见的遗传性肌肉疾病，而X连锁肌管性肌病是一种更罕见的遗传性肌肉疾病。他们还发现，MyoAAV可以有效地将基因疗法传递给非人类灵长类动物的肌肉和人类肌肉细胞。
这些发现是Tabebordbar十年研究的成果，他的职业生涯一直致力于为遗传性肌肉疾病寻找更好的基因疗法。当Tabebordbar还是个少年时，他的父亲开始出现行走困难，并最终坐上了轮椅。后来他的父亲被诊断出患有一种罕见的遗传性肌肉疾病。
Tabebordbar说，“我看着我的父亲一天比一天更糟糕。作为一个家庭一起做事是一个巨大的挑战---遗传病不仅对患者，而且对家庭都是一种负担。我想，这对患者非常不公平，一定要有办法解决这个问题。这是我在基因治疗领域从事研究的10年中的动力。”
Tabebordbar说，“已经有许多衣壳工程研究，我们从中学到了很多，但我们在这项新的研究中所做的是非常全面的。我们进化出一个衣壳家族，发现了它递送基因的机制，表明这一机制在物种之间是保守的，并表明我们可以用极低剂量的病毒在动物模型中提供治疗效果。如今，我们对如何利用这一点为患者进行有效的药物开发感到非常兴奋。”
聚焦肌肉
基因治疗领域在恢复一系列遗传疾病的功能失调性基因的功能性拷贝方面取得了重大进展。向肌肉细胞递送功能性基因已显示出治疗肌肉疾病的前景，但一直是个挑战。Tabebordbar说，“科学家们在过去15年里一直在进行体内基因治疗的临床前工作，并取得了巨大的进展。我们知道，如果你将足够的药物送入靶组织，它将是有效的。关键在于提供安全剂量的病毒。”
Sabeti和他的团队从基因治疗中常用的基因递送载体AAV9开始，并使用DELIVER来提高它将基因递送到肌肉细胞的能力。
Sabeti团队首先通过向AAV衣壳暴露在病毒表面并与细胞结合的部分添加一串随机的氨基酸，产生了数百万种不同的AAV衣壳。他们然后将这些AAV衣壳注射到小鼠和非人类灵长类动物体内，并对整个身体的肌肉组织进行取样和测序，以寻找成功递送所携带的基因货物的AAV衣壳。他们发现了一个具有独特表面结构的衣壳变体家族---MyoAAV，特异性靶向肌肉细胞，并将MyoAAV用于下一步：尝试在动物模型中治疗遗传性肌肉疾病。
Tabebordbar说，“我们的方法是独特的，因为我们筛选了一系列广泛的AAV衣壳，并使用了非常严格的选择标准。我们想找到的AAV衣壳不仅可以物理上进入细胞，而且可以通过不同的转导步骤进行，并表达所携带的转基因。”
小鼠体内的基因修复
在杜兴氏肌营养不良症的小鼠模型中，与携带CRISPR-Cas9的常规AAV9相比，携带CRISPR成分的MyoAAV在肌肉组织中导致了更广泛的功能障碍基因dystrophin的修复。经MyoAAV治疗的小鼠的肌肉也显示出更大的力量和功能。
通过与波士顿儿童医院的Alan Beggs实验室合作，Tabebordbar团队发现，MyoAAV对治疗小鼠所患的X连锁肌管性肌病（X-linked myotubular myopathy, XLMTM）也很有效，这种疾病导致小鼠在大约10周后就会死亡。在接受了比目前用于临床试验的病毒剂量低100倍后，研究中用MyoAAV治疗的所有六只小鼠都和正常小鼠一样长寿，而用AAV9治疗的小鼠只能活到21周龄。
为非人类灵长类动物设计的MyoAAV也将基因递送到这些动物的肌肉中，其效率远远高于目前在临床试验中使用的自然发生的AAV衣壳。MyoAAV还在实验室中成功地将基因导入人类细胞。各种MyoAAV衣壳使用类似的机制将基因递送到小鼠和人类肌肉细胞，这表明MyoAAV可有效地用于不同物种的肌肉定向基因递送。
Wagers说，“所有这些结果证明了MyoAAV载体对肌肉递送的广泛适用性。这些载体在不同的疾病模型和不同的年龄、品系和物种中发挥作用，这表明了这个AAV家族的强大。我们拥有关于这类载体的大量信息，该领域可以从中启动许多令人兴奋的新研究。”
Sabeti团队包括布罗德研究所Sabeti实验室的研究生Kim Lagerborg、Alexandra Stanton和Simon Ye，他们认为DELIVER有潜力为任何类型的组织提供高度特异性的病毒衣壳，这可能会刺激影响各种器官的医疗需求尚未得到满足的遗传疾病的基因疗法的开发。
Sabeti说，“我们开发出一个精确地靶向骨骼肌的病毒衣壳家族，我们已经能够通过多个临床前阶段和多个疾病模型来测试。我们经历了很多很多临床前步骤来寻找有可能在不久的将来准备用于临床的东西。”
参考资料：Mohammadsharif Tabebordbar et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell, 2021, doi:10.1016/j.cell.2021.08.028.
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