基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。2020年10月，德国马克斯-普朗克病原学研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美国加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士因在CRISPR-Cas9基因编辑方面做了的贡献荣获2020年诺贝尔化学奖。
CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。
图片来自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。
2018年11月26日，中国科学家贺建奎声称世界上首批经过基因编辑的婴儿---一对双胞胎女性婴儿---在11月出生。他利用一种强大的基因编辑工具CRISPR-Cas9对这对双胞胎的一个基因进行修改，使得她们出生后就能够天然地抵抗HIV感染。这也是世界首例免疫艾滋病基因编辑婴儿。这条消息瞬间在国内外网站上迅速发酵，引发千层浪。有部分科学家支持贺建奎的研究，但是更多的是质疑，甚至是谴责。
即将过去的9月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。
1.Science：重大进展！发现一种新型的切割RNA的III型CRISPR-Cas系统
doi:10.1126/science.abk2718
在一项新的研究中，荷兰代尔夫特理工大学的Stan Brouns博士及其研究团队发现了一种新型的可以切割RNA的III型CRISPR-Cas系统。这一发现预计将为基因研究和生物技术的新应用开发提供许多机会。相关研究结果于2021年8月26日在线发表在Science期刊上，论文标题 为“The gRAMP CRISPR-Cas effector is an RNA endonuclease complexed with a caspase-like peptidase”。
图片来自Science, 2021, doi:10.1126/science.abk2718。
在这项新的研究中，这些作者描述了来自Candidatus “Scalindua brodae”的III-E型效应物，称为Sb-GRAMP，它由一个具有几个III型结构域融合在一起的单个基因天然编码。这种效应物使用CRISPR RNA（crRNA）来引导靶RNA的识别，并在相隔6个核苷酸的两个确定的 位置切割单链RNA。耐人寻味的是，Sb-GRAMP与caspase-like TPR-CHAT肽酶物理结合，形成Craspase（CRISPR引导的Caspase）复合物，从而提出了靶RNA诱导蛋白酶活性以获得病毒免疫的潜在机制。
Brouns说，“自2006年以来，我们一直试图了解CRISPR-Cas系统，并且不断发现CRISPR-Cas的新变体，可以用于重要的应用。例如，CRISPR-Cas9允许对细胞中的DNA进行非常精确的编辑。这在研究界掀起了一场真正的革命，例如在研究遗传性疾病方面。CRISPR-Cas系统 也被证明是众所周知的PCR检测冠状病毒的一种令人关注的替代选择。我们如今发现的这种新的III型CRISPR-Cas系统不是在DNA上起作用，而是在RNA上起作用，这提供了一系列新的可能性。”
2.Cell：开发出一种新的基因递送载体---MyoAAV，有潜力使基因疗法更安全和更有效地肌肉疾病
doi:10.1016/j.cell.2021.08.028
遗传性肌肉疾病导致渐进性肌肉萎缩，经常导致早期死亡，治疗选择很少，也无法治愈。一些基因疗法使用无害的病毒载体将致病基因的功能性拷贝递送给细胞，在临床试验中显示出对一部分肌肉营养不良症的治疗前景，但也面临挑战。携带功能性基因拷贝的病毒载体需要高剂量才能到达整个身体的肌肉，而这些临床试验中使用的病毒载体往往最终地更多地进入肝脏而不是肌肉。这导致肝脏中的病毒载体含量过高，出现严重的不良副作用，甚至导致一些临床试验参与者的死亡。
在一项新的研究中，来自美国布罗德研究所和哈佛大学等研究机构的研究人员开发出一个新的腺相关病毒（AAV）家族---基因治疗中的基因递送主力，它们改善了对肌肉组织的靶向性，这对肌肉疾病患者可能更安全、更有效。这组病毒载体（他们称之为MyoAAV）到达肌肉的效率比目前临床试验中使用的病毒载体高10倍以上，并且在很大程度上避开了肝脏。他们发现，由于这种效率的提高，MyoAAV可用于递送治疗性基因，其剂量比其他研究和临床试验中使用的病毒载体低约100至250倍，有可能减少肝脏损伤和其他严重副作用的风险。相关研究结果于2021年9月9日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species”。论文通讯作者为哈佛大学教授、布罗德研究所成员Pardis C. Sabeti、Sabeti实验室的Mohammadsharif Tabebordbar和哈佛大学干细胞与再生生物学系教授Amy Wagers。
图片来自Cell, 2021, doi:10.1016/j.cell.2021.08.028。
在这项新的研究中，这些作者描述了他们如何修改AAV的外层蛋白外壳，即所谓的衣壳，以构建MyoAAV。他们使用了一种他们开发的名为“利用转基因RNA在体内表达的AAV衣壳定向进化（Directed Evolution of AAV capsids Leveraging In Vivo Expression of transgene RNA, DELIVER）”的方法做到了这一点。
利用MyoAAV，这些作者将治疗性基因或CRISPR-Cas9基因编辑系统专门递送给肌肉细胞。他们改善了杜兴氏肌营养不良症小鼠模型和X连锁肌管性肌病小鼠模型的肌肉功能，其中杜兴氏肌营养不良症是最常见的遗传性肌肉疾病，而X连锁肌管性肌病是一种更罕见的遗传性肌肉疾病。他们还发现，MyoAAV可以有效地将基因疗法传递给非人类灵长类动物的肌肉和人类肌肉细胞。
3.Science：重大进展！CRISPR大牛张锋教授发现一类极具应用潜力的新型基因编辑系统---转座子编码的RNA引导的DNA内切酶
doi:10.1126/science.abj6856
在过去十年内，科学家们已经将来自微生物的CRISPR系统改造成了基因编辑技术，这是一种精确的、可编程的修改DNA的系统。如今，在一项新的研究中，来自美国麻省理工学院麦戈文研究所和布罗德研究所的研究人员发现了一类新的可编程的DNA修改系统，称为OMEGA（Obligate Mobile Element Guided Activity），它们可能天然地参与了在整个细菌基因组中重排小片段 DNA的工作。相关研究结果于2021年9月9日在线发表在Science期刊上，论文标题为“The widespread IS200/605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases”。
这些古老的DNA切割酶由小片段RNA引导到它们的靶标。虽然它们起源于细菌，但它们如今已被设计成能在人体细胞中起作用，这表明它们在开发基因编辑疗法方面可能是有用的，特别是因为它们很小（大约为Cas9的30%），使它们比体积较大的DNA切割酶更容易被递送到细胞中。这一发现提供了证据表明，天然RNA引导的酶是地球上最丰富的蛋白质之一的，并指出了一个巨大的生物学新领域，该领域有望推动基因组编辑技术的下一次革命。
OMEGA蛋白可能由RNA引导的第一个暗示来自于称为IscB的蛋白编码基因。IscB不参与CRISPR免疫反应，也不知道是否与RNA结合，但它们看起来像小型的DNA切割酶。Zhang团队发现，每个IscB附近都有一个小RNA，它指导IscB酶切割特定的DNA序列。他们将这些RNA命名为“ωRNA”。Zhang团队的实验表明，另外两类称为IsrB和TnpB的小蛋白（细菌中最丰富的基因之一）也使用ωRNA作为向导来指导DNA切割。IscB、IsrB和TnpB存在于称为转座子的可动遗传因子中，具体而言存在IS200/IS605转座子家族中。论文共同第一作者Han Altae-Tran解释说，每次这些转座子移动时，它们都会产生一个新的gRNA，使它们编码的酶能够在基因组的其他地方进行切割。
4.Nature：重大进展！发现一种精确切割RNA的CRISPR系统---Cas7-11
doi:10.1038/s41586-021-03886-5
在一项新的研究中，来自美国麻省理工学院麦戈文研究所的研究人员发现了一种细菌酶，他们说这种酶可以扩大科学家们使用的CRISPR工具箱，使其能够轻松地切割和编辑RNA，而在此之前，这种精确性只适用于DNA编辑。这种他们最终命名为Cas7-11的细菌酶在不伤害细胞的情况下修改RNA靶标，这表明除了是一种有价值的研究工具外，它还为治疗应用提供了一个肥沃的平台。相关研究结果于2021年9月6日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Programmable RNA targeting with the single-protein CRISPR effector Cas7-11”。
额外的III-E型家族成员和新颖的III-D2型位点结构和具有代表性的同源物的多重比对。图片来自Nature, 2021, doi:10.1038/s41586-021-03886-5。
当这些作者通过公共数据库来研究不同细菌防御系统的组成部分时，一种从日本东京湾分离出来的细菌Desulfonema ishimotonii的蛋白质引起了他们的注意。它的氨基酸序列表明，它属于一类CRISPR系统，该系统使用大型的多蛋白复合物来寻找和切割它们的目标。但是这种蛋白质似乎拥有它所需要的一切，可以独立完成这项任务。Koonin说，其他已知的单蛋白Cas酶，包括已被广泛用于DNA编辑的Cas9蛋白，属于CRISPR系统的一个单独类别，但是Cas7-11模糊了CRISPR分类系统的界限。他们最终将这种蛋白质命名为Cas7-11。
Cas7-11从工程的角度来看是很有吸引力的，因为单一的蛋白质更容易被递送到细胞中，并且比复杂的多蛋白复合物更容易成为编辑工具。但是它的组成也标志着一个意想不到的进化史。这些作者发现有证据表明，通过进化，更复杂的Cas机器的组件融合在一起，形成了Cas7-11蛋白。Gootenberg将此等同于当你之前认为鸟类是唯一会飞的动物时发现了蝙蝠，从而认识到有多种进化路径来实现飞行。他说，“这完全改变了人们对CRISPR系统的思考方式，无论是在功能上还是在进化上。”
5.Mol Cell：新成果！科学家开发出一种高效的迷你CRISPR基因编辑系统！
doi:10.1016/j.molcel.2021.08.008
紧凑和多功能的CRISPR-Cas系统能通过在各种情况下的高效传递从而实现基因组的工程化研究及应用；对CRISPR基因编辑技术最常见的比喻就是，其工作方式就好像是分子剪刀，能够减掉DNA的特定部分；近日，一篇发表在国际杂志Molecular Cell上题为“Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing”的研究报告中，来自斯坦福大学等机构的科学家们在CRISPR研究领域取得重大突破，他们开发出了一种高效多用途的迷你CRISPR系统，常用的CRISPR系统（携带诸如Cas9、Cas12a多种版本的CRISPR相关蛋白）由大约1000-1500个氨基酸组成，而这种新型迷你CRISPR系统（CasMINI）则仅由529个氨基酸组成。
目前研究人员制造出了一个相当好的系统，他们正在考虑如何将这种分子尽快应用起来。除了蛋白质工程研究外，研究者还设计了引导Cas9蛋白抵达其靶点DNA的特殊RNA，对这两个组件的修饰或许对于使CasMINI系统能在人类细胞中发挥作用至关重要；随后研究人员测试了CasMINI在实验室基于人类的细胞中的剔除和编辑基因的能力；包括与HIV感染、抗肿瘤免疫反应以及与贫血有关的基因；这对于他们所测试的每一个基因都起作用，而且在多个基因中都有强烈的反应。
6.Science：重大进展！发现一种新型的切割RNA的III型CRISPR-Cas系统
doi:10.1126/science.abk2718
在一项新的研究中，荷兰代尔夫特理工大学的Stan Brouns博士及其研究团队发现了一种新型的可以切割RNA的III型CRISPR-Cas系统。这一发现预计将为基因研究和生物技术的新应用开发提供许多机会。相关研究结果于2021年8月26日在线发表在Science期刊上，论文标题为“The gRAMP CRISPR-Cas effector is an RNA endonuclease complexed with a caspase-like peptidase”。
在这项新的研究中，这些作者描述了来自Candidatus “Scalindua brodae”的III-E型效应物，称为Sb-GRAMP，它由一个具有几个III型结构域融合在一起的单个基因天然编码。这种效应物使用CRISPR RNA（crRNA）来引导靶RNA的识别，并在相隔6个核苷酸的两个确定的位置切割单链RNA。耐人寻味的是，Sb-GRAMP与caspase-like TPR-CHAT肽酶物理结合，形成Craspase（CRISPR引导的Caspase）复合物，从而提出了靶RNA诱导蛋白酶活性以获得病毒免疫的潜在机制。
图片来自Science, 2021, doi:10.1126/science.abk2718。
Brouns说，“自2006年以来，我们一直试图了解CRISPR-Cas系统，并且不断发现CRISPR-Cas的新变体，可以用于重要的应用。例如，CRISPR-Cas9允许对细胞中的DNA进行非常精确的编辑。这在研究界掀起了一场真正的革命，例如在研究遗传性疾病方面。CRISPR-Cas系统也被证明是众所周知的PCR检测冠状病毒的一种令人关注的替代选择。我们如今发现的这种新的III型CRISPR-Cas系统不是在DNA上起作用，而是在RNA上起作用，这提供了一系列新的可能性。”
7.Nucleic Acids Res：利用I-F型CRISPR-Cas系统高效编辑超级细菌
doi:10.1093/nar/gkab521
在一项新的研究中，来自中国香港大学的研究人员开发出一种可转移的整合的基于I型CRISPR的平台，它可以有效地编辑铜绿假单胞菌的不同临床分离株，其中铜绿假单胞菌是能够感染多种组织和器官的超级细菌，是院内感染的主要来源。该技术可以加速识别多药耐药（MDR）病原体的耐药性决定因素，并开发新的抗耐药性策略。相关研究结果近期发表在Nucleic Acids Research期刊上，论文标题为“A transferrable and integrative type I-F Cascade for heterologous genome editing and transcription modulation”。论文通讯作者为香港大学理学院分子与细胞生物学研究部副教授Aixin Yan博士。
此前，Yan博士及其团队在临床多药耐药的铜绿假单胞菌菌株PA154197中发现了一种高度活跃的I-F型CRISPR-Cas系统，其中该菌株是从香港玛丽医院的一个血流感染病例中分离出来的。他们对这一CRISPR-Cas系统进行了表征，并在这种天然的I-F型CRISPR-Cas系统的基础上成功开发了适用于这种MDR分离株的基因组编辑方法。该方法使快速鉴定MDR临床分离株的耐药性决定因素和开发新的抗耐药性策略成为可能（Cell Reports, 2019, 29, 1707-1717）。
为了克服将这种复杂的I型Cascade转移到异源宿主的障碍，在这项研究中，Yan团队将整个I-F型cas 操纵子克隆到精通整合的载体mini-CTX中，并通过接合（一种自然界中常见的DNA转移方法）将它递送到异源宿主。mini-CTX载体能够将整个Cascade整合到异源宿主基因组中保守的attB基因座上，使它们能够容纳一种能够稳定表达和发挥作用的天然I-F型CRISPR-Cas系统。他们发现，与可转移的CRISPR/Cas9系统相比，转移的I-F型Cascade显示出明显更强的DNA干扰能力和更高的菌株稳定性，并可被用于基因组编辑，效率高（>80%）且简单，即通过一步转化单一编辑质粒即可实现。
8.Science：新技术可在体内快速进行大规模CRISPR筛选
doi:10.1126/science.abi8870
作为一种小型的快速生长的生物，斑马鱼与人类具有很多相同的基因。斑马鱼对许多生物学家来说很重要，因为他们发现斑马鱼非常适合研究一系列问题，从有机体如何发育到神经系统如何驱动行为。如今，在一项新的研究中，来自美国犹他大学、布莱根妇女医院、哈佛医学院和麻省总医院的研究人员开发出一种名为MIC-Drop的新技术，这种技术可使斑马鱼在大规模基因研究方面将变得更加强大。相关研究结果于2021年8月19日在线发表在Science期刊上，论文标题为“MIC-Drop: A platform for large-scale in vivo CRISPR screens”。论文通讯作者为犹他大学药理学与毒理学学系化学生物学家Randall Peterson博士。
MIC-Drop（Multiplexed Intermixed CRISPR Droplets, 多重混合CRISPR液滴）通过将CRISPR系统的组分包装成微观的油包液滴来解决这个问题，这些油包液滴可以在不混合其内含物的情况下混合在一起。为了用MIC-Drop对许多基因进行筛选，Peterson团队首先构建出一个gRNA文库。每个gRNA与Cas9酶一起被包装在自己的液滴中。为了跟踪靶基因，每个油包液滴还包括一个识别其内含物的DNA条形码。
MIC-Drop是一种基于crispr的新技术，可以快速有效地筛选斑马鱼中数百个基因的功能，以更好地了解人类健康和疾病。图片来自Science, 2021, doi:10.1126/science.abi8870。
Peterson团队对油包液滴的化学成分进行了微调，以确保它们保持稳定和离散性，因此针对不同基因设计的油包液滴可以混合在一起并装入同一针头。在显微镜下，MIC-Drop使用者将单个油包液滴注射到斑马鱼胚胎中，然后转到下一个胚胎并注射下一个油包液滴。这个过程可以重复数百次，向每个胚胎提供一套CRISPR组分，因此在每个胚胎中，该系统都能灭活单个基因，然后这些作者监测对斑马鱼的潜在影响。
为了展示MIC-Drop的潜力，这些作者测试188个不同的斑马鱼基因在心脏发育中的潜在作用。在构建针对这些基因的gRNA并将CRISPR系统引入数百个斑马鱼胚胎后，他们发现有一些斑马鱼在成熟后出现了心脏缺陷。利用这些斑马鱼体内的DNA条形码，他们能够将这些缺陷追溯到13个不同基因的失活。由于斑马鱼和人类基因之间的相似性，这一发现可能指向人类心脏发育中以前未知的方面。
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