ALS是一种致命的运动神经元疾病，由大脑和脊髓的上下运动神经元退化引起。该病导致四肢、躯干、胸部、腹部肌肉逐渐无力并萎缩，从而影响运动、语言、吞咽和呼吸功能，最终致死。尽管目前批准用于ALS临床的药物有利鲁唑和依达拉奉，然而都没有达到令人满意的效果。近年来人们将治疗重点转移到了基因治疗。1993年发现第一个ALS致病基因，迄今为止，已发现50多个基因与ALS相关，120多个基因突变可能会增加患ALS或改变其表型的风险。近30年时间里，ALS相关的基因治疗研究已经步入临床治疗阶段，因为它有可能通过减弱功能获得性毒性或改善基因水平来纠正潜在的致病机制。迄今为止最有前途的基于基因治疗的ALS治疗方法包括反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotides，ASO）治疗、腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）介导的基因沉默和传递。

ASO已被证明在治疗广泛的遗传疾病方面非常有效，第一个ASO疗法于1998年获得FDA批准。ASO是单链合成核酸，长度通常为12-30个核苷酸，可将序列特异性结合至靶RNA，并可通过多种机制调节蛋白质表达。

1. 超氧化物歧化酶1（superoxidedismutase1，SOD1）

SOD1基因是1993年被发现的第一个ALS的致病基因，是ALS中常见的基因靶点。在动物模型结果的基础上，ASO-SOD1治疗药物BIIB067在2013年已进行了Ⅰ期临床试验(NCT01041222)，该I期临床试验结果显示：和安慰剂相比，鞘内注射SOD1-ASO治疗的耐受性好，无严重不良反应发生，证实了ASO-SOD1治疗的安全性。随后在2015年，该治疗开展了新一代ASOTofersen(BIIB067)在SOD1-ALS患者的Ⅰ/Ⅱ期临床试验研究（NCT02623699)，患者在12周内接受了5次腰椎鞘内注射，不同治疗组每次注射的剂量分别为20、40、60或100mg，初步结果显示，在40，60和100mg治疗组中，患者脑脊液(Cerebro-SpinalFluid，CSF)中SOD1蛋白浓度显著降低，100mg治疗组中CSFSOD1蛋白水平浓度下降36%，CSF神经丝水平（ALS神经变性的生物标志物）有所降低，且100mg治疗组ALS功能评分量表得分和慢肺活量的下降率均减慢。包括安慰剂组在内的所有患者均报告了不良反应，尽管大多数与鞘内腰椎穿刺有关，例如头痛和腰椎穿刺后综合征。尽管如此，总的来说，该试验证明了所有剂量的安全性。在2019年，为期28周的Ⅲ期随机双盲临床试验（VALOR，NCT02623699）启动，但28周后未达到ALSFRS-R衡量的主要终点，治疗并未显着减缓疾病进展（p=0.97），可能由于时间相对较短，也有可能在治疗开始时，复杂的下游病理事件是独立于突变体SOD1蛋白水平的自我维持，只有在病程的早期才能进行有效的干预。一项新的临床Ⅲ期试验（ATLAS，NCT04856982）目前正在进行中，本次试验可能解决在治疗窗口早期开始试验的最佳时机这一问题。

2. 9号染色体开放阅读框72（chromosome9openreadingframe72，C9ORF72）

C9ORF72基因中的六核苷酸扩增（hexanucleotideexpansion，HRE）是ALS最常见的遗传原因，ASO可以穿透细胞核，因此有可能靶向新转录的前体mRNA以及那些隔离在RNA中的前体mRNA。2018年开始了针对C9ORF72抗ASO的首次临床试验(NCT03626012)，本Ⅰ期研究的主要目的是评估BIIB078（鞘内给药剂量递增）在C9-ALS患者中的安全性和耐受性，次要目的是评估BIIB078的药代动力学特性及其对临床功能的影响，最终结果显示尽管BIIB078普遍耐受性良好，但它没有达到任何次级感染终点，与安慰剂组相比，也没有显示出临床益处。BIIB07890mg剂量组的参与者在次要终点上比安慰剂组有更大的下降趋势。最终，BIIB078临床开发项目，包括其正在进行的开放标签扩展研究，停止进行。之后开展了Ⅰb/Ⅱa期临床试验（FOCUS-C9，NCT04931862），WVE-004是，评估WVE-004（一种靶向携带HRE的C9ORF72mRNA变体的立体光学ASO）的安全性和耐受性，该研究仍在进行中，计划于2023年初完成。

3. 肉瘤融合（fusedinsarcoma，FUS）

2009年发现16号染色体上的FUS基因突变是ALS的致病因素，FUS是一种普遍表达的RNA结合蛋白，主要位于细胞核中，参与DNA修复和RNA代谢的多个方面，例如转录、翻译、pre-mRNA剪接、mRNA转运和稳定性，以及microRNA和其他非-编码RNA，其中，FUS中描述最多的突变是错义突变。FUS的第一个ASO治疗是由NeilShneider团队进行的，最初由IonisPharmaceuticals公司开发的ASO（ION363）。一名25岁的FUS-ALS患者因FUSP525L突变发生病程快速进展，进行递增的ION363鞘内注射，从20mg开始到最大每月剂量120mg，在10个月内总共输注了12次，治疗耐受性良好，无严重不良事件，在治疗过程中，ALSFRS-R评分的下降速度大幅放缓。免疫组化显示ION363在患者CNS中广泛分布，大脑中的总FUS蛋白和P525L突变体FUS蛋白均减少90%或更多，整个中枢神经系统的病理性FUS聚集减少。之后另外10名患者进行ION363治疗。2021年开始进行Ⅲ期临床试验（NCT04768972），以确定ION363是否为有症状的FUS-ALS患者提供减缓疾病进展的临床益处，该研究将于2024年初完成。

4. TARDBP(TDP-43) 

TDP-43是一种DNA/RNA结合蛋白，由TARDBP基因编码，主要存在于细胞核中，在多种细胞过程中发挥作用，包括转录抑制，前mRNA剪接，mRNA稳定性，microRNA生物发生，RNA转运和翻译调控。在疾病状态下，TDP-43在细胞核中缺失，在97%的ALS和50%的FTD患者中发现为高磷酸化、聚集的细胞质内含物。

5. Ataxin-2（ATXN2）

ATXN2是一种RNA结合蛋白和应激颗粒组装的调节因子，ATXN2基因内编码聚谷氨酰胺的CAG束的扩增可能是ALS的危险因素。基于动物模型研究的积极结果，今年开始Ⅰ期研究（Biogen，NCT04494256），ALS患者无论是否在ATXN2中有CAG重复扩增，都将通过鞘内注射接受四剂BIIB105中的一剂，主要结果是确定潜在的不良事件，BIIB105的药代动力学是次要结果，该研究将于2024年结束。

近年来开发了几种旨在减少SOD1的AAV基因治疗策略，包括使用shRNA、miRNA、AAV传递反义序列、CRISPRCas9和针对SOD1的抗体。第一种方法发表的是针对AAV9传递的SOD1的shRNA，基于动物模型研究，在首次人体研究中两个SOD1-ALS病例均使用FDA批准的方案接受4×10AAVRh10.miR-SOD1基因组的鞘内输注。第一例在输注5周后出现中枢神经系统炎症反应和肝酶升高，最终尸检与健康对照组和未经处理的具有相同突变的个体相比，脊髓SOD1蛋白水平降低了90%，右侧腰骶脊髓中的运动神经元得到了显著保护。第二例没有出现炎症反应，病程总体稳定，ALSFRSR评分从28分降至24。ApicBio将对在2022年底开始Ⅰ/Ⅱ期临床研究。另一种沉默SOD1的方法使用了AAVrh10，该方法表达一个外显子2靶向反义序列，跳过外显子2产生一个过早的终止密码子，该策略结合了ASO和AAV载体的特性，具有无需重新给药的优势，防止了重新管理的需要，这在针对大脑和脊髓时很有用，多个小组开发了由AAV提供的CRISPR/Cas9策略来破坏SOD1的表达，该方法基本处于动物模型试验阶段，随着技术的进一步发展，这些技术在ALS领域的应用备受期待。

与大多数ALS基因可能有许多不同的疾病发生突变不同，只有C9ORF72中的HRE被证明会导致病理变化，使得C9ORF72基因成为基因校正的有力候选者，可使用aav9介导的CRISPR/Cas9基因编辑方法，利用靶向刺激HRE的序列的gRNAs去除GGGGCCnHRE。使用CRISPR/Cas9的缺点之一是可能在编辑站点插入和删除，这种风险通过靶向内含子而减弱，其中插入和缺失不太可能改变C9ORF72蛋白的氨基酸组成或改变转录水平。

尽管很少有主要的ALS致病突变是由突变的ALS基因功能丧失引起的，但AAV介导的基因传递在ALS领域具有潜力。目前没有发现导致ALS突变具有独有的功能丧失机制，因此治疗性转基因传递集中在神经营养因子上，为退化的神经元提供支持。神经营养因子是一种典型的与神经元生长或存活相关的分泌蛋白，在ALS动物模型和患者中，已经发现神经营养因子随着时间的推移而下降，表明它在保护神经元方面具有潜在的作用。此外，还有AVV介导的非营养因子的传递，包括神经肌肉连接调节剂和聚集靶向治疗。由AAV介导的工作，大部分集中在SOD1小鼠试验上。

基因疗法正在成为治疗许多疾病的有力治疗方法，但ALS基因治疗还面临其他挑战，如何更好地实现因血脑屏障而限制载体在中枢神经系统的生物分布，如何在安全和治疗窗口内靶向足够数量的细胞以实现足够水平的基因增强或抑制等问题。

无论是单独使用还是与针对ALS 各种病理机制的其他更常规疗法相结合，都将显著减缓 ALS 疾病的进展。毫无疑问，继续研究基因调节方法、载体和策略，并加深对相关治疗挑战和局限性的理解，将为临床成功奠定基础。

参考文献：

1.FangTon,JeGoun,PacutPeter,etal.GeneTherapyinAmyotrophicLateralSclerosis.Cells.2022;11(13).doi:10.3390/cells11132066

2.MeijboomKatharinaE,BrownRobertH.ApproachestoGeneModulationTherapyforALS.Neurotherapeutics.2022;19(4)：1159-1179.doi:10.1007/s13311-022-01285-w